<走馬灯の逆廻しエッセイ> 第23話 「二本鎖RNAウイルスゲノムのクローニング (Imai & Furuichi)」

古市 泰宏

研究者の楽園

1970年の終わりごろには、キャップの研究は大きく広く進展していて「もう私の出番はない」ように思われた。誰かとバッティングしたり、枚挙的であるように思え、一種の燃え尽き症候群になっていたのかもしれない。すでに数年前に日本の遺伝学研究所は辞職し、ロシュ分子生物学研究所 (RIMB) の室長として独立した研究室をもらっていたのでーーー生活には困らない。「ポスドクは内部昇格を許さない」というルールがあるなか、筆者は、客員研究員だからということで、1976年から、研究所のメンバーに昇格していた。

RIMBは後に「研究者の楽園」といわれるほどに恵まれ研究所で、グラント (公的研究費) の申請は必要なく、研究テーマの選択も自由であった。さりとて、製薬会社がスポンサーになっている研究所であるから、分子生物学とはいえ、ロシュ社になにか貢献したいなとは、思っていた。所長のユーデンフレンド博士がーーー「研究所の自由度」を守るために「会社側への盾となって」苦労されていることをーーー、所長の親しい友人である早石修先生から聞いていたからである。でも、インターフェロンα (IFN) の遺伝子が、3階 (Biochemistry Dept.) のSid Pestka博士のグループによりクローニングされており、ロシュ社はIFNタンパク質を、抗がん・抗ウイルス医薬品として開発しようとして、新興のジェネンテク社と交渉中だった。このほか、2階 (Pharmacolgy Dept.) のSid Spector博士が発明したーーー乱用薬物を抗体で感知するーーーAbu・Screen/Rocheが軍隊で採用されているなど、研究所の貢献は、すでにロシュ社に認知されていた。しかしながら、筆者のいる4階 (Cell biology Dept.) からは、トップレベルの雑誌への発表論文数は、断トツであるものの、応用につながるような研究成果はまだ無かったーーー実際、基礎研究から応用研究への展開は中々難しい。

基礎から応用への時間軸

一方、スイス・バーゼルにあるバーゼル免疫学研究所も、ロシュ社が100%支援している研究所だが、こちらは「ノーベル賞受賞者をすでに3人も出していて」同研究所の利根川進博士 (1987年ノーベル医学・生理学賞受賞) も、すでにノーベル賞への呼び声が高かった。免疫学研究所では、ーーーヨーロッパの感覚であろうかーーー親元のロシュへ恩返しをしようとするなどの気分は毛頭なかったようである。しかし、それから20年近くたって(~1997年)、モノクローン抗体技術の成果が、抗体医薬を生み出すことになり、ロシュ社は、抗体技術のノウハウを得て、現在にいたるまで、抗体医薬のチャンピオンとして活躍している。筆者たちも、創薬のターゲットとして「インフルエンザウイルスに特異的なキャップ拉致反応」を利用した抗インフル医薬品が胸中にあったが、当時のロシュ社は、興味を示さなかった。1980年代は、エイズウイルスやHCVへの対応に主眼が置かれ、インフルエンザウイルスが顧みられることはなかった。しかし、縁というものは不思議である。「里帰り」というか、Sloan Kettering研究所のKrug博士と、RIMBの我々とで見つけた「キャップ依存的エンドヌクレアーゼ」を標的とした「ゾフルーザ」が、本邦のシオノギ製薬で発見され、その臨床試験などへロシュ社が肩入れして、FDAによる医薬品への承認を得て、世界ではゾフルーザをロシュが販売することになったのは「不思議な縁」であると思わざるを得ない。基礎から応用へは、ゆったりとした時間軸が、必要であるようだ。

二本鎖RNAウイルス遺伝子のDNAクローニングと解析

この時期、逆転写酵素が発見され、RNAがDNAへ変換することができるようになったので、Maxam・Gilbert法により、そのDNA配列が読めるようになっていて、mRNAがコードするタンパクのアミノ酸配列が判るようになった。新着雑誌には次々と、mRNAの配列が報告されるようになっていて、それがキャップ研究の筆者らには、とても羨ましかった。3'末端にPolyAを持つmRNAであれば、オリゴdTをプライマーにして、二本鎖DNAへ変換することが出来るので、mRNAのクローニングは誰でも出来るようになったのである。

しかし、二本鎖RNAを遺伝子として持つ蚕・CPVウイルスや、ヒト・レオウイルスや、下痢を起こすロタウイルスでは、mRNAも遺伝子もPolyAを持たず、そんなこともあって、DNAクローニングの舞台から置き去りにされていた。筆者にとっては、二本鎖RNAウイルスは、キャップ発見の故郷でもあるので、キャッピング酵素やメチル化酵素の立体構造などを知りたいと思っていた。二本鎖RNAウイルス遺伝子のDNA化には、まず、3'末端へPolyA、あるいはタグになるオリゴヌクレオチドをつけて、逆転写酵素が働く足場をつけなければならない。そこで、フルサイズの遺伝子RNAを一網打尽にクローニングする戦略を暖めていたのだが (図1)、これを実際にやってくれるプレーヤーがいなかった。

大晦日の客

そんな時、1980年の大晦日に、日本から強力な助っ人がやってきた。今井光信博士である (第21話のあとがきに写真がある)。今井さんは、後に神奈川衛生研究所の所長となって、HIVやC型肝炎ウイルス (HCV) の輸血用血液へのコンタミを検出する研究で大活躍するが、この時、自治医科大学の真弓忠教授の元で助教として、正体不明のC型肝炎ウイルス (―――A型ウイルスでもない、B型ウイルスでもないので、NonA/NonBウイルスと呼ばれていた) を探索していた免疫学研究者である。真弓教授が率いる日本肝炎研究グループでは、「NonA/NonBウイルスの正体は、RNAかDNAか不明だが、クローニング技術でしか見つけられない」ということで、遺伝子クローニング技術を習得するために今井博士が、私の研究室に送り込まれたようであった。私は、なるべく日本人をとらない方針でいたのだが、今井さんが来てからは、私の研究室には、常に日本人研究者がいることになってしまった。夜になると、日本人の誰かが私のオフィスへ来るようになってきて、―――アメリカの中に小さな日本が出来つつあったーーー。英語で過しているストレス一杯の一日が終わり、気楽に日本語で話せる雰囲気が楽しいからであろう。タバコが吸えるので来る人もいたーーー松尾寿之先生 (後に、宮崎医科大学学長) がそうなのであるが、他にも、武藤誠さん (東大・薬、京大・医)、浅野富子さん (愛知身障者コロニー研)、江尻慎一郎さん (東北大・農) など、後に帰国して活躍された人が多かった。

丸太は一本では燃えない

さて、大晦日の客の今井博士だが、単身で渡米されたので、ひとまず我が家へひきとり、一緒に年末年始を過ごすことにした。今井さんとは、それが初対面だった。遠来の客ということで、久しぶりに暖炉に火を起こした。そして、これまでのこと、今後のことなど、暖炉の火を見ながら、じっくり話し合った。私にはそれが快適だったが、付き合わされた今井さんは、時差の関係で、眠くて大変だったろうと思われる。

「あっ、今井さん、おもしろいことを見つけたよ」

「えっ、何です」

「この暖炉の中の丸太ねーーー」

「はい」

「一本では、燃えないが、2本の燃えて面を向かい合わせると、よく燃えることを見つけたよ、ほら。」

 (実際、この発見は、大発見だった)

「あっ、ほんとですね。やあ、良く燃えますね」

「研究も、こんなもんかもね。一人では弱い火だが、二人で向かい合って協力すれば、強く燃えるかも」

「ほんとに、いいものを見つけましたね」(今井さんは逆らわない人だ)

「ここで、ぼやぼやしていてもしょうがないから、さっそく研究室へ行って、バッファーでも作ろうか」

「ああ、いいですね、眠くてしょうがなかったんです。連れてってください。」

―――ということで、大晦日の夜に、門番にことわって、誰もいない研空所へ入り、私は、研究室を案内し、彼は、慣れた手つきで、試薬棚から試薬を取り出して、早速、バッファーや試薬溶液を作ったりした。実験が好きで、実験馴れている今井博士ならではのことだった。彼も、海外留学最初の夜にバッファーを作るなんて思ってもみなかったことであろう。案外、それは、時差を解消するには良い方だったかもしれない。

2本鎖RNAの3'末端へのオリゴ(C)15テーリング

逆転写反応でcDNAを合成するために、2本鎖RNAの3'末端へオリゴ(C)15 をT4・RNAリガーゼを用いて結合させることにした。2本鎖RNAとしては、これまでキャップ発見の際に使ってきた蚕のCPVウイルスや、レオウイルス、それからロタウイルスから抽出したRNAを使ったが、全てうまくいった。オリゴCには、5'と3'の両末端にリン酸をつけて、自身がライゲーションしないように、細工を凝らしたが、こんな前段階プロセスは今井さんにとって核酸科学入門のよい学習になったと思われる。

図1
図1.2本鎖RNAウイルス遺伝子のクローニング

さいわい、2本鎖RNAをフルサイズで2本鎖DNAにして、pBR322に組み込むことが出来た。そして、ウイルスの10本の分節遺伝子それぞれに対するクローンは、32P・pCpでラベルした各分節RNAをプローブにして分別した。こうして、3種類のウイルスについて、30本ほどの分節遺伝子を全てクローニングして、充実した1年間を終えた今井さんは、同じフロアの皆さんから盛大な送別会を開いてもらって、日本へ帰国していった。しかし、彼はすぐまた戻ってくることになる。今度は、正式にRIMBのポスドクに採用されたので、家族を連れて来ることができたのである。勿論、大歓迎だった。そして、以前に釣り上げたDNAクローンの多くについて、こんどはDNA配列を決定する仕事にとりかかった。これらの仕事は、2本鎖RNA遺伝子のクローニングとしては世界で最初の仕事だった。大阪国立病院の池上信子先生から送られて来た病原性ロタウイルスの11番目の分節遺伝子について、RNA配列を決定し、PNAS誌へ発表した123,124

この稿を書いている2019年9月26日夜、NHKニュースで、ロタウイルスのワクチン無料化のニュースが流れている。40年前に、今井さんとロタウイルス遺伝子のクローニングに懸命に働いた日々をしみじみ思い出して (たとえば図2――筆者が実験中の写真)、「きっとお役にたっているよ」と家内に話かけるが、ーーー残念ながら、反応はそっけなくーーー2本の燃えている丸太ではない。

図2
図2.筆者が実験中の写真

ロタウイルスDNAによる診断方法の確立

ロタウイルスなど2本鎖RNAウイルスの遺伝子は、10~11本の分節2本鎖遺伝子よりなっていて、一つの分節遺伝子 (セグメントともいう) は一つのタンパクをコードしている。それらの遺伝子はRNAポリメラーゼやキャッピング酵素、メチル化酵素、それから粒子タンパクなどを、独立して、コードしている。ロタ、蚕CPV、レオの3種類のウイルスについて合計30本のセグメントRNAをDNAクローニングしたのであるが、やはり、アフリカなどで蔓延している病原性ロタウイルスに最も強い興味が集まった。ロタのクローンDNAを使って、日本、米国、オーストラリア、ニュージランドのWHO委員の研究者と広い共同研究ネットが広がった125。血清表面抗原 (serotype-specific antigen VP7) は、第9 RNAセグメントにコードされている。この当時、東大医学部・微生物学へ移っていた野本明男さんと協力して、第9と第10番目のRNAセグメントのDNAクローンの塩基配列を決定し126,127、VP7をコードする第9セグメントに関しては、その配列をサルやウシのロタウイルスのDNA配列でも調べ、抗原性の「種による違い」などをJ. Virologyに共著で発表した127。野本さんとは、学生時代にベンチを並べて学んだ先輩・後輩の仲だったが、それから15年を経て、海を越えて、ロタウイルスのDNAクローンをネタに、共同研究することが出来たのは、ことさらに嬉しいことだった。また別の論文中、ハイブリダイズ法によるロタウイルスのDNA感染診断法についてもDNAの利用を確認したが128,129、この経験は、後に今井さんらの努力による、ーーー献血で集められた血液中のHCVの混入を調べるーーーDNA診断法の実際に結び付いたと思われる130

あとがき

<留学にもいろいろ>

留学にもいろいろあるが、今井さんの留学は変わっていた。自費で1年間ーーーまず、足入れ留学しーーー、次には、受け入れ側の費用で、家族を連れて2年間留学するという方法で、経済的に許せば、これは賢明な方法だ。留学直前に結婚して、新婚旅行の延長で留学する人もいたが、「その後が、いろいろ大変だろうな」と心配したものだった。私のように小学生を含む子供3人を連れて留学するのは苦労が多かった。子供を学校へ入れたりして、ストレスが家族全員へかかるからである。当家の場合、苦労したのは家内であろう。ただ、アメリカでは、品行方正であれば周囲が優しく迎えてくれるから、何とかやってゆけたーーーいまはもう、その間の苦労を思い出すことは―――家内はともかく、筆者にはない。

偉大なウイルス研究者Bill Joklik教授の訃報

今井さんのPNAS論文がdsRNA遺伝子クローニングで先陣を切ったあと、翌年、Duke大学のBill Joklik教授 (Wolfgang Joklik) の研究室から、PolyAポリメラーゼを使うテーリング方法でレオウイルスの遺伝子dsRNAをクローニングした論文が出て、2本鎖RNAウイルスの遺伝子クローニングやその解析は、世界的にポピュラーな分野になった。Joklik博士はオーストリア人で、オーストラリアで育ち、米国へ帰化した国際人で、永くVirology誌の編集長をつとめて、分子ウイルス学の分野を先導したウイルス科学者だった。同様に、レオウイルス研究者で、J.Virologyの編集長だった (筆者のボスの) Shatkin博士とは色んな意味でライバル関係にあったが、学会などでは、Joklik博士は、テニスなどへ快く誘ってくれるので、筆者は気にしないで交友を楽しんだ。そのJoklik博士が今年7月に93歳で亡くなったという訃報を知った。Duke大学では永く学部長をつとめられたので、多くの日本人留学生がお世話になったと思われるが、ご冥福を祈りたい。

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